Анотація до роботи:

Книш О.В. Дослідження впливу факторів кріоконсервування на морфофункціональні властивості тромбоцитів людини. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.35 – кріомедицина. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.

Дисертація присвячена вивченню впливу ряду факторів кріоконсервування на структурну цілісність та функціональні властивості тромбоцитів крові людини на етапах низькотемпературного консервування. Досліджено здатність кріопротекторів різних класів хімічних сполук перехоплювати гідроксильні радикали у модельній системі їх генерації та впливати на інтенсивність процесів ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”. Показано, що вихідний морфофункціональний стан тромбоцитів, композиційний склад кріозахисного середовища і швидкість охолодження суспензії клітин в температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур мають визначальний вплив на параметри структурної цілісності та функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів. Вперше експериментально доведено, що застосування комбінації ДМАЦ з 1,2-ПД підвищує ефективність кріоконсервування тромбоцитів порівняно із застосуванням кожного з кріопротекторів окремо. Встановлена можливість ефективного кріоконсервування концентратів тромбоцитів, виділених з лейко-тромбоцитарного шару, які зберігалися упродовж 18 – 24 годин при температурі 22 ± 2 С.

У дисертаційній роботі проведено теоретичне узагальнення проблеми низькотемпературного консервування тромбоцитів крові людини і експериментально обґрунтований новий підхід до її вирішення. На основі дослідження впливу ряду факторів кріоконсервування на показники структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів визначені умови підвищення збереженості їх життєздатності та гемостатичного потенціалу на етапах низькотемпературного консервування.

1. Встановлено, що композиційний склад кріозахисного середовища і швидкість охолодження суспензії клітин в температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур мають визначальний вплив на параметри структурної цілісності та функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів (агрегаційна здатність, реакція на гіпотонічний шок, здатність до накопичення флуорохрому, активність цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі). Вперше експериментально доведена доцільність використання комбінацій кріопротекторів у складі кріозахисного розчину при кріоконсервуванні тромбоцитів.

2. Показано важливе значення ступеня активації тромбоцитів на етапі виділення з донорської крові: концентрати тромбоцитів, отримані з лейко-тромбоцитарного шару, характеризувалися за всіма досліджуваними параметрами нижчим ступенем активації і виявили вищий рівень збереженості морфофункціональних властивостей до і після кріоконсервування порівняно з концентратами тромбоцитів, отриманими із збагаченої тромбоцитами плазми.

3. Встановлено, що всім дослідженим кріопротекторам притаманна антирадикальна активність. За здатністю перехоплювати гідроксильні радикали у модельній системі їх генерації кріопротектори розташувалися у порядку зростання: гліцерин < диметилацетамід < оксиетильований гліцерин зі ступенем полімеризації 5 1,2-пропандіол < диметилсульфоксид.

4. Характер впливу кріопротекторів на інтенсивність перекисного окислення ліпідів у системі “тромбоцити-плазма” залежить від їх хімічної природи та концентрації. З ряду досліджених кріозахисних сполук 1,2-пропандіол та диметилацетамід у кінцевій концентрації 0,7 М суттєво не впливають на рівень пероксидації ліпідів, навіть за умови індукції іонами заліза. Не виявлено залежності між здатністю кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів в модельній системі та характером їх впливу на процеси перекисного окислення ліпідів в системі “тромбоцити-плазма”.

5. Експозиція тромбоцитів протягом 30 хвилин з диметилсульфоксидом, диметилацетамідом та 1,2-пропандіолом у кінцевій концентрації 0,7 М, за умов мінімізації осмотичного та механічного стресу при введенні та видаленні кріопротекторів розробленим способом [Пат. №15014 Україна, 2006], не викликає значних змін їх морфофункціонального стану. З підвищенням концентрації кріопротекторів до 1,4 М виявляються ознаки активації, порушення агрегаційних та осморегуляторних властивостей тромбоцитів.

6. Встановлена залежність збереженості структурної цілісності та функціональних властивостей тромбоцитів від швидкості охолодження у температурному інтервалі кристалізації (від 0/-1,5 до -35…-40 C). Значення фактору швидкості охолодження в даному температурному інтервалі зростає зі зменшенням вмісту кріопротектора у складі кріозахисного середовища, а особливо – за його відсутності. Процедура температурної ініціації кристалізації сприяла підвищенню ефективності кріоконсервування концентратів тромбоцитів лише за умови наступного застосування певної контрольованої швидкості охолодження. Розроблена програма заморожування концентратів тромбоцитів, яка передбачає процедуру температурної ініціації кристалізації з подальшим охолодженням зі швидкістю 6 – 7 С/хв в даному температурному інтервалі.

7. Експериментально доведена важливість застосування контрольованої швидкості охолодження в зоні евтектичних температур (від -35…-40 до -80 C). Порівняльний аналіз результатів кріоконсервування концентратів тромбоцитів з диметилсульфоксидом виявив залежність ступеня пошкодження тромбоцитів від швидкості охолодження в даному температурному інтервалі: спостерігалася тенденція до підвищення збереженості тромбоцитів при охолодженні із швидкістю 25 – 30 C/хв у порівнянні із швидкостями 0,5 – 1 С/хв, 5 – 7 С/хв, 10 – 15 С/хв та достовірні відмінності у порівнянні зі швидкістю, що реалізується при прямому зануренні в рідкий азот.

8. Заморожування тромбоцитів за розробленою програмою у середовищі, що містить комбінацію диметилацетаміду з 1,2-пропандіолом у кінцевій концентрації 0,7 М, підвищує рівень збереженості структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів після кріоконсервування порівняно із застосуванням кожного з кріопротекторів окремо.

9. Експериментально визначені умови підвищення ефективності кріоконсервування концентратів тромбоцитів людини є реальною основою подальшої розробки і впровадження в роботу низькотемпературних банків крові технології їх довгострокового низькотемпературного зберігання для використання у практичній медицині.

Публікації автора:

1. Компанієць А.М., Книш О.В., Гуріна Т.М., Богданчикова О.А., Овсянніков С.Є., Погребняк М.Л. Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування // Проблемы криобиологии. – 2006. – Т. 16, № 2. – С. 182 – 191.

2. Книш О.В., Овсянніков С.Є., Нікітченко Ю.В., Компанієць А.М. Дослідження антирадикальних властивостей кріопротекторів та їх впливу на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма” // Медична хімія. – 2006. – Т. 8, № 3. – С. 25 – 28.

3. Книш О.В., Гуріна Т.М., Богданчикова О.А., Овсянніков С.Є., Нікітченко Ю.В., Компанієць А.М. Вплив кінетики охолодження на результати кріоконсервування тромбоцитів крові людини // Міжвідомчий збірник “Гематологія і переливання крові”, випуск 33. – К.: Нора-друк, 2006. – С. 113–118.

4. Книш О.В. Вплив вихідного морфофункціонального стану тромбоцитів на результати їх кріоконсервування // Актуальні проблеми сучасної медицини. Вісник Української медичної стоматологічної академії. – 2007. – Т. 7, випуск 3 (19). – С. 170 – 173.

5. Пат. № 15014 Україна, МПК8 А0N 1/02. Спосіб видалення кріопротектора із суспензії тромбоцитів / Грищенко В.І., Компанієць А.М., Книш О.В. / Заявл. 18.11.05; Опубл. 15.06.06, Бюл. № 6.

6. Овсянников С.Е., Кныш О.В., Никитченко Ю.В., Компаниец А.М. Исследование антиоксидантных свойств криопротекторов различных классов химических соединений // Сборник трудов “Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека”. – Смоленск, Россия, 2005. – С. 366 – 368.

7. Книш О.В., Овсянніков С.Є., Компанієць А.М. Дослідження впливу кріопротекторів на рівень спонтанного та індукованого іонами заліза ПОЛ у системі тромбоцити-плазма-кріопротектор // Український біохімічний журнал. – 2005. – Т. 77, № 5. – С. 143.

8. Книш О.В., Овсянніков С.Є., Компанієць А.М. Порівняльна характеристика антирадикальних властивостей кріопротекторів у системах: модельній та “тромбоцити-плазма” // Проблемы криобиологии. – 2005. – Т. 15, № 4. – С. 740 – 741.

9. Овсянников С.Е., Кныш О.В., Линник Т.П., Компаниец А.М. Зависимость антирадикальной активности криопротекторов ряда полиолов и их оксиэтильных производных от химической структуры // Збірник матеріалів ІХ Українського біохімічного з’їзду. – Харків, 2006. – Т. 1. – С. 156 – 157.